История, археология и этнография Кавказа
History, Archeology and Ethnography of the Caucasus

Введение

Современная археология рассматривает пищу как важную составляющую материальной культуры и коллективной идентичности древних народов и племен [1; 2]. Рацион населения мог отражать расслоение общества, быть результатом климатических сдвигов или изменений ресурсной базы [1]. Большинство исследований археологической пищи относятся к археоботанике [3] и археозоологии [4; 5; 6; 7]. Археоботанические остатки, как правило, сохраняются благодаря обугливанию [8; 9; 3]. Без пирогенного воздействия могут сохраняться зерна крахмала [10]. Большой массив данных о характере растительной пищи был получен в результате многочисленных исследований посуды и инструментов, предназначенных для перетирания употребляемых растений [11; 12; 13; 14]. В области археозоологии применяется таксономическая оценка фрагментов костей животных [6; 15]; методы палеопротеомики [7] и палеогеномики [16]. Анализ остеологических материалов из погребений раннего железного века позволил установить особенности видового и анатомического состава костей животных в погребальных комплексах различных категорий. В категории «напутственная пища» чаще всего встречались мясные части туш МРС, а в категории «жертвенный комплекс» – головы лошадей, реже КРС или мясные части туш МРС [17]. При изучении поселения золотоордынского времени Подымалово-1 были установлены относительные объемы потребления мяса домашних копытных, с применением коэффициента кратности весовых показателей туш разных видов, причем основное значение как в хозяйстве, так и в мясном питании принадлежало крупному рогатому скоту и лошади [18]. В погребениях I–II вв. в окрестностях поселения Херсонес 1 мясо копытных животных, как правило, располагалось в сосудах открытых форм (тарелки, миски, чашки, блюда), а в погребениях III–IV вв. – непосредственно на земле или поверх костей погребенного [19]. В качестве дополнительного археозологического материала могут рассматриваться костяные украшения и бытовые орудия из кости [20].

Если повреждение костей затрудняет их морфологический анализ, для таксономической идентификации животных применяется фингерпринтинг («отпечатки пальцев») – масс-спектрометрия маркерных пептидов коллагена, характерных для каждого таксона [21]. Метабаркодирование ДНК/РНК костей животных позволяет идентифицировать сразу несколько видов в одном образце костной массы [22].

К наиболее сложным объектам экспериментальной археологии относятся остатки ферментированных продуктов: хлеб, сыр, алкогольные изделия. В древних обществах эти продукты были центральными компонентами рациона [23]. При ферментации простые сахара преобразуются в спирт, органические кислоты и углекислый газ в микроаэрофильных или анаэробных условиях. Благодаря деятельности пробиотических бактерий повышается питательная ценность продукта и подавляется развитие патогенных микроорганизмов [24; 25].

Считается, что процессы ферментирования зерна, винограда и фруктов были открыты в Египте и  Месопотамии в 4 тысячелетии до н.э. [26]. Древняя выпечка содержала как дрожжи, так и молочнокислые бактерии [27]. Штаммы дрожжей в керамических порах древних гончарных сосудов оказались генотипически похожими на современные дрожжи традиционных африканских напитков [28]. Анализ генетического разнообразия европейских и ближневосточных дрожжей указывает на тесную взаимосвязь между дрожжами хлеба и пива [23]. К одним из наиболее ранних одомашненных штаммов могли принадлежать дрожжи, ДНК которых была выделена из сосудов, датируемых 3150 г. до н. э. [29]. Однако, анализ ДНК современных дрожжевых штаммов, с учетом их генетических мутаций, позволяет предполагать, что одомашнивание древнейшего штамма S. cerevisiae произошло гораздо раньше, около 11000 лет назад [23].

Не менее длинной является история соложения. Возникновение пивоварения относится к начальным стадиям выращивания зерновых. В раннем неолитическом Китае соложение начали практиковать около 7000 лет до н.э. [30; 31], в Судане – около 9000 лет до н.э. [32; 33], в Греции его связывают с появлением первой керамики [34], а в Центральной Америке – с началом использования кукурузы [35]. О производстве пива из зерновых свидетельствует наличие орудий труда – каменных бассейнов, точильных камней и очагов, а также остатков ячменя [36; 33]. К древнейшим методам соложения относится изготовление баппира – пивного хлеба, жевание зерна и применение плесневых грибов [37; 38]. В пивоварении молочнокислое брожение наиболее часто индуцируется молочнокислыми бактериями Lactobacillus, Leuconostoc и Pediococcus [39].

В отличие от редких находок пищевых артефактов, погребальные сосуды в захоронениях встречаются повсеместно. Исходное содержимое большинства сосудов полностью разложилось к настоящему времени, однако в грунте их заполнения могут сохраняться следы пищи: ферменты, связанные с ее разложением [40; 41; 42] и покоящиеся формы микроорганизмов, в том числе – бактерий, осуществляющих молочнокислое брожение [43]. Впервые наличие бактерий, способных к молочнокислому брожению, было показано Е.В. Демкиной при изучении содержимого сосуда эпохи бронзы катакомбной культуры XVI–XV вв. до н.э. [44].

Цель настоящей работы заключалась во введении в научный оборот новой информации о трофической структуре и таксономической диагностике микроорганизмов, сохранившихся в придонном грунте заполнения ритуальных сосудов из разновозрастных погребений на территории различных регионов. Исследование продолжает серию работ по комплексному изучению обширного блока образцов из древних сосудов, собранных на территории степной зоны, из могильников разных эпох и разной культурной принадлежности. Выбор степной зоны обусловлен минимальным влиянием внешних условий на микробные сообщества в грунте сосудов, поскольку промачивание почвы на глубину погребений в  большей части случаев здесь не происходит, в отличие от лесной зоны. Ранее в этих же образцах нами проводилась оценка численности липолитических бактерий, использующих жиры в качестве источника питания, и комплексная оценка липазной активности [40–43]. В связи с тем, что полнота археологических данных в рассматриваемом блоке образцов сильно варьирует (для большинства сосудов известно только время погребения, но не известны внешний вид и величина сосуда, а также пол и возраст погребенного), в настоящей работе мы не ставили задачу оценить особенности погребальной пищи по микробиологическому следу в различных археологических контекстах. В задачи входило оценить соотношение трофических групп микробных сообществ в грунте сосудов, выделить консорциумы пищевых бактерий и провести таксономическую идентификацию биотехнологически значимых штаммов, выделенных в чистые культуры. Проведенная ранее диагностика чистой культуры, полученной из грунта заполнения античной ойнохойи из погребения №370 грунтового могильника Волна-1, показала сходство выделенного штамма с известным штаммом Sporolactobacillus pectinivorans [43]. В настоящей работе идентификация этого штамма была уточнена, с учетом его более высокого генетического сходства с другим видом споролактобацилл – Sporolactobacillus vineae. Диагностика остальных биотехнологически значимых штаммов микроорганизмов, полученных из 16 образцов грунта погребальных сосудов, была проведена нами впервые. Мы полагаем, что настоящая работа важна для получения представлений о микроорганизмах, принимавших участие в ферментации пищевых продуктов прошлых эпох.

Объекты и методы исследования

Объектами исследования были пробы грунта из погребальных сосудов следующих археологических памятников (таблица 1): Братские-1 курганы (III–IV вв. н.э., аланская культура, Чеченская Республика), Октябрьский (III–I половина V в. н.э., аланская культура, РСО-Алания), Волна-1 (V–III  вв. до  н.э, Таманский полуостров), Литвиновский (III тыс. до н. э. – XIV в. н. э., Ростовская область), Волхонские выселки (XXVII–XXII вв. до н.э., Липецкая область), Нор-Армавир (VII в. до н. э., урартская культура, Армения), «Мецамор» (конец V тыс. до н.э., урартская культура, Армения).

Археологические сосуды пронумерованы в том порядке, в котором они будут приводиться в обсуждении результатов (табл. 2). Всего было проанализировано 42 образца грунта. Образцы отбирались в  поле, с соблюдением асептических условий, из придонного слоя толщиной 1–2 см и хранились в  лаборатории в герметически закрытых пластиковых пакетах при комнатной температуре.

Методы исследований

Исследование на всех этапах, за исключением таксономической идентификации бактерий и дрожжей, проводилось в лаборатории археологического почвоведения ИФХиБПП РАН. Определение таксономической принадлежности бактерий и дрожжей проводилось в ЦКП Биоинженерия ФИЦ «Фундаментальных основ биотехнологии» РАН.

Оценка численности трофических групп микроорганизмов. Для оценки численности трофических групп микроорганизмов, способных к участию в разложении пищевых продуктов, проводился посев из грунта на твердые питательные среды. Подробная методика посева и состав сред представлены в  Приложении 1.

Липолитические микроорганизмы, растущие на твердой питательной среде с добавлением Твин-80, связаны с разложением жиров. Широкий спектр протеолитических микроорганизмов, участвующих в разложении белков, учитывался на мясопептонном агаре (МПА) или дрожжевом пептонном агаре (ДПА). В качестве диагностической среды для подсчета протеолитических бактерий, предпочитающих белки молока, мы выбрали среду М-17, используемую для роста молочнокислых бацилл. Амилолитические микроорганизмы, способные к усвоению крахмала, выращивались на крахмалоаммиачном агаре (КАА). Олиготрофная группа, к которой относится большинство почвенных микроорганизмов, использующих низкие концентрации органических веществ после их утилизации всеми вышеперечисленными группами, учитывалась на почвенном агаре (ПА).

Таблица 1. Типы сосудов и номера погребений (*отмечены сосуды, откуда проводилось выделение чистых культур биотехнологически значимых микроорганизмов (см. Приложение 3) / Table 1. Vessel types and burial numbers (*asterisks indicate vessels from which pure cultures of biotechnologically significant microorganisms were isolated; see Appendix 3).

№	Могильник	Погребение	Тип сосуда
1	Волна-1	681	Ойнохойя
2	Братские-1 курганы	1425	Кружка
3	Братские-1 курганы	1443	Кувшин
4	Братские-1 курганы	1373	Миска
5	Октябрьский I	861	Кувшинчик
6	Октябрьский I	837	Кувшин №1
7	Октябрьский I	1063	Кружка
8	Октябрьский I	1063	Кувшинчик
9	Братские-1 курганы	1395	Миска
10	Октябрьский I	802	Кувшинчик
11	Октябрьский I	838	Кувшин
12	Волна-1	370	Ойнохойя*
13	Волна-1	352	Амфора
14	Октябрьский I	857	Миска*
15	Братские-1 курганы	1469	Кувшин
16	Октябрьский I	815	Кувшинчик
17	Братские-1 курганы	1383	Кружка
18	Волна-1	680	Кувшин
19	Братские-1 курганы	1452	Кувшин*
20	Октябрьский I	815	Корчага*
21	Братские-1 курганы	1355	Миска*
22	Октябрьский I	814	Кружка
23	Литвиновский	К1(10)	Горшок*
24	Октябрьский I	837	Кувшин №2
25	Октябрьский I	14	Кувшинчик
26	Октябрьский I	14	Миска
27	Братские-1 курганы	1452	Кувшин (подношение)*
28	Литвиновский	К. 1 (16)	Курильница
29	Волхонские выселки	К. 1 (1)	Горшок
30	Братские-1 курганы	1355	Кувшинчик
31	Братские-1 курганы	1452	Кружка
32	Октябрьский I	265	Кувшинчик
33	Братские-1 курганы	1452	Миска*
34	Нор-Армавир	Раскоп Л-7	Горшок №2*
35		Раскоп Л-7	Горшочек №3*
36		Раскоп Л-7	Кубок №4*
37		Раскоп Л-7	Кувшин №5*
38		Раскоп Л-7	Кубок №6*
39		Раскоп Л-7	Кувшин №7*
40		Раскоп Л-7	Горшочек №10*
41	Мецамор	Культурный слой	Кувшинчик SF 223*
42		Культурный слой, сектор A1, контекст 687	Кувшинчик SJ 2*

Выделение консорциумов микроорганизмов, способных к молочнокислому брожению. Консорциумы (ассоциации) микроорганизмов, способных к ферментации пищевых продуктов, были выделены путем инкубирования образцов грунта в жидкой питательной среде Elliker, используемой для выделения из природных источников молочнокислых стрептококков [45] и на среде MRS, используемой для выделения молочнокислых бацилл [46]. Подробная методика выделения и состав сред представлены в Приложении 2. Оценка морфологии клеток в консорциумах проводилась методом люминесцентной микроскопии, после окраски препаратов акридином оранжевым.

Выделение чистых культур микроорганизмов, способных к молочнокислому брожению, и определение их таксономической принадлежности. Чистые культуры биотехнологически значимых микроорганизмов, способных осуществлять молочнокислое брожение, были выделены из грунта погребальных сосудов на среде Rogosa (см. Приложение 2). Выделение ДНК из биомассы бактерий проводили согласно методу [47]. Для оценки таксономической принадлежности бактерий проводилось секвенирование ПЦР-фрагментов гена 16Sр-РНК. Для оценки таксономической принадлежности грибов исследовался участок гена рибосомального оперона ITS1–5.8S–ITS2–28Sр-РНК. Более подробно методика оценки таксономической принадлежности микроорганизмов представлена в Приложении 3.

Результаты и обсуждение

Развитие микробных сообществ в погребальных сосудах после смешивания пищи с грунтом заполнения могильной ямы, в зависимости от характера пищи, могло происходить следующим образом. Твердые продукты с высоким содержанием жира и низкой его дисперсией (такие как жирное мясо, масло, сыр) формировали зоны с низкой доступностью кислорода, где преимущество получали бактерии, обладающие липолитической активностью и способные к росту в микроаэрофильных и анаэробных условиях. При этом нарушение воздушного режима почвы подавляло рост автохтонных олиготрофных бактерий. Жидкие продукты с низким содержанием питательных веществ не нарушали воздушный режим почвы и могли служить источником питания для олиготрофных почвенных микроорганизмов. Жидкие молочные продукты, включающие белок и жир в диспергированном состоянии [48], способствовали росту численности всех групп микроорганизмов, как пищевых, так и почвенных.

На рис. 1 представлена кластеризованная тепловая карта численности трофических групп микроорганизмов в образцах с низкой интенсивностью их роста на твердых питательных средах (до 1,5 млн ­КОЕ/г почвы). Преобладающими группами здесь были липолитические бактерии, утилизирующие жир, и олиготрофные бактерии, растущие на почвенном агаре.

В отдельный кластер выделен образец № 1 – ойнохойя из погребения 681 грунтового могильника Волна-1. Здесь численность всех трофических групп, кроме олиготрофов, не превышала 0,3 млн ­КОЕ/г почвы. Повышенная численность олиготрофных бактерий в образце свидетельствует о том, что почвенное микробное сообщество могло принимать непосредственное участие в разложении напитка, который содержался в ойнохойе. Проведенная ранее таксономическая идентификация штамма Sporolactobacillus, выделенного нами из грунта ойнохойи, позволила с высокой вероятностью установить здесь исходное наличие вина [43].

Два объекта следующего кластера – № 2 (кружка из погр. 1425) и № 3 (кувшин из погр. № 1443) курганного могильника Братские-1 курганы – отличались относительно высокой численностью липолитических бактерий на фоне предельно низких значений численности остальных групп.

Остальные сосуды группировались в два крупных кластера по численности и соотношению липолитических и олиготрофных микроорганизмов. Низкая численность олиготрофных бактерий отмечена в образцах № 4–13. При этом в грунте из четырех сосудов (№ 8–11) микробный след не наблюдался. Эти сосуды могли быть пустыми или содержали только воду. Остальные варианты могли содержать низкокалорийную пищу. О возможности ее ферментации свидетельствуют смешанные бактериальные культуры, способные к сбраживанию молока, выделенные из сосудов № 1, 6, 12–14, 16, 18, 19 (табл. 2).

На рис. 2 представлены результаты кластерного анализа численности трофических групп в образцах с высокой интенсивностью их роста на питательных средах. Все эти сосуды содержали жирную пищу, о  чем свидетельствует преобладание липолитических бактерий, численность которых достигала 12 млн КОЕ/г почвы. В отдельную группу выделялись миска и кружка из детских погребений (№ 21 и №  22). Здесь с наибольшей вероятностью можно предположить исходное присутствие жидких молочных продуктов, поскольку отмечено высокое изобилие протеолитических бактерий на содержащей лактозу среде М-17, а высокая численность олиготрофных микроорганизмов свидетельствует

о  благоприятном воздушном режиме. Известно, что жир в плазме молока присутствует в диспергированном состоянии. Жировая фаза представлена микроскопическими шарообразными каплями, средний диаметр которых сопоставим с размерами микробных клеток – от 2 до 2,5 мкм [48]. Жидкие молочные продукты не нарушают воздушный режим почвы и не препятствуют развитию автохтонной почвенной микрофлоры.

Таблица 2. Результаты сбраживания молока консорциумами бактерий (культурами, состоящими из нескольких штаммов или видов), выделенными из археологических сосудов, при 40°С (*отмечены образцы, способные к сбраживанию молока при 30°С) / Table 2. Results of milk fermentation at 40°C by bacterial consortia (cultures consisting of several strains or species) isolated from archaeological vessels (*asterisks indicate samples capable of fermenting milk at 30°C).

Могильник	Образец	Время образования молочного сгустка смешанной культурой
Литвиновский	№ 28 курильница К.1 (П.16)	Более суток
Нор-Армавир	№ 34 горшок №2 (Л-7)
	№ 35 малый горшок №3(Л-7)
	№ 38 кубок №6 (Л-7)
	№ 39 кувшин №7 (Л-7)
Волна-1	№1 ойнохойя (681)
	№12 ойнохойя (370)	3 часа*
	№18 кувшин (680)
	№13 амфора (352)	6 часов
Братские-1 курганы	№33 миска (1452)	3 часа
	№31 кружка (1452)	Более суток
	№19 кувшин (1452)
	№27 кувшин-подношение (1452)
	№21 миска (1355)
Октябрьский	№16 кувшинчик (815)	3 часа
	№6 кувшин №1 (837)	Длительное
	№14 миска (857)	Длительное
	№22 кружка (814)	Длительное

В отдельную подгруппу был выделен образец № 23 – горшок эпохи бронзы из курганного могильника Литвиновский. Грунт из этого горшка отличался максимальной численностью липолитических бактерий и низкой численностью остальных групп. Следы исходного продукта в горшке представляли собой тлен бурого цвета, комковато-порошистой структуры. В образце № 28 – курильнице из того же могильника – был обнаружен аналогичный тлен. Благодаря высокой численности липолитических бактерий курильница № 28 заняла отдельное положение в кластере III. Здесь могли содержаться жир или смола, употребляемые при совершении ритуалов погребального обряда.

Верхнюю подгруппу кластера III составили образцы № 24–26 – кувшин, кувшинчик и миска из курганного могильника Октябрьский. Ни в одном из этих сосудов не был обнаружен морфологически различимый тлен, однако ингибирование роста всех микробных групп, кроме липолитических бактерий, может ­свидетельствовать о создании анаэробных условий вследствие смешивания почвы с  гидрофобной жировой фазой.

Нижняя подгруппа кластера III включала более равновесные варианты трофической структуры микробных сообществ. Здесь обращает на себя особое внимание образец № 27 – кувшин-подношение из  коллективного погребения 1452. Грунт из кувшина отличался повышенной численностью бактерий, разлагающих белок. Инкубация микробного консорциума из грунта кувшина № 27 в анаэробных условиях, при 24% углекислого газа в отсутствие кислорода, позволила обнаружить с помощью люминесцентной микроскопии клетки возбудителя ботулизма – Clostridium botulinum. Такие же результаты были получены для кувшина № 19, принадлежавшего мужчине из погребения 1452, а в миске №  21 из  детского погребения 1355 С. botulinum не выявлялся. Известно, что подавляющее число случаев ботулизма связаны с употреблением мяса [49], тогда как случаи заражения молочных продуктов клостридиями считаются достаточно редкими [50; 51; 52]. Попадание С. botulinum в пищевые продукты, как правило, происходит вследствие недостаточной очистки сырья от почвенных частиц, поэтому ­интенсивное заражение содержимого погребальных сосудов спорами С. botulinum очевидно, происходило после контакта пищи с грунтом заполнения могильной ямы. Но условия для прорастания спор возбудителя ботулизма могли быть благоприятными только в случае прекращения доступа кислорода. Кроме того, выделение кислот другими видами пищевых микроорганизмов могло блокировать рост С.  botulinum. Порча продуктов в погребениях – как молочнокислое брожение (в случае молока), так и аэробное гниение (в  случае мяса), сопровождалась увеличением кислотности среды. Однако в отдельных зонах заполнения погребального сосуда могли развиваться анаэробные условия, давая преимущество развитию почвенных клостридий, в том числе – С. botulinum. Необходимо отметить, что С. botulinum является одним из агентов анаэробного гниения белка в составе мяса, рыбы или продуктов растительного происхождения, тогда как маслянокислое брожение молока в анаэробных условиях вызывают другие виды клостридий  – такие, как С. butyricum и C. pasteurianum. Таким образом, содержимое кувшинов № 19 и  № 27 по  наличию С. botulinum можно идентифицировать как не молочный белковый продукт.

Кластер IV, включающий кружку из коллективного погр. 1452 курганного могильника Братские-1 курганы, найденную у скелета женщины (№ 31) и кувшинчик из погр. 265 курганного могильника Октябрьский I (№ 32), характеризовался высокими значениями численности липолитических микроорганизмов – до 6 млн КОЕ / г почвы. Пища в этих сосудах была более калорийной, по сравнению с  образцами из кластера III. В кружке №31 мог содержаться зерновой продукт, на что указывает высокая численность амилолитических бактерий, растущих на крахмалоаммиачном агаре.

Таким образом, анализ двух групп образцов грунта, различающихся по биологической активности микробных сообществ, выявил частые случаи повышенной численности липолитических бактерий. Здесь же наблюдались наименьшие коэффициенты вариации 62–78%, по сравнению с остальными трофическими группами – от 100 до 150%. Таким образом, липолитические микроорганизмы, как наиболее устойчивые к условиям погребения, были выделены в качестве оптимального маркера присутствия пищи в погребальных сосудах.

В образце № 33 численность трофических групп микробного сообщества не оценивалась из-за чрезвычайно малого количества материала. Образцы № 34–42, в целом, характеризовались низкой ­интенсивностью роста микроорганизмов на питательных средах, однако по результатам генетического анализа выделенных культур, однозначно, содержали пищевые продукты.

Из 13 сосудов (табл. 3) были выделены и идентифицированы чистые культуры бактерий, способных к сбраживанию молока: Sporolactobacillus terrae (№ 23, 34–40); Sporolactobacillus vineae (№ 12); Heyndrickxia coagulans (№ 19, 33, 41); Heyndrickxia acidiproducens (№ 42). Из двух сосудов были выделены условно патогенные спорообразующих бациллы, перспективные для биотехнологии: Bacillus licheniformis (№ 21); Bacillus thuringiensis (№ 27). Дрожжи Candida sp. были выделены из сосудов № 14 и № 20. Филогенетическое положение выделенных штаммов представлено в приложении 4 (рис. 1–3).

Таблица 3. Результаты таксономической идентификации чистых культур микроорганизмов из грунта сосудов археологических памятников / Table 3. Taxonomic identification results of pure microbial cultures isolated from the sediment of vessels from archaeological sites.

Могильник	Образец	Микроорганизм
Бактерии
Литвиновский	№ 23 Горшок К1(10)	Sporolactobacillus terrae
Нор Армавир	№ 34 Горшок №2 (Л-7)
	№ 35 Горшочек №3 (Л-7)
	№ 36 Кубок №4 (Л-7)
	№ 37 Кувшин №5 (Л-7)
	№ 38 Кубок №6 (Л-7)
	№ 39 Кувшин №7 (Л-7)
	№ 40 Горшочек №10 (Л-7)
Братские-1 курганы	№ 19 Кувшин (1452)	Heyndrickxia coagulans
	№ 33 Миска (1452)
Мецамор, культурный слой	№ 41 Кувшинчик SF 223
	№ 42 Кувшинчик SJ 2 (сектор A1, контекст 687)	Heyndrickxia acidiproducens
Волна-1	№ 12 Ойнохойя (370)	Sporolactobacillus vineae
Братские-1 курганы	№ 21 Миска (1355)	Bacillus licheniformis
	№ 27 Кувшин (1452)	Bacillus thuringiensis
Дрожжи
Октябрьский I	№ 14 Миска (857)	Дрожжи Candida sp.
Октябрьский I	№ 20 Корчага (815)

Представители рода Sporolactobacillus входят в состав пищевых продуктов [53], некоторые из них могут быть связаны с ферментацией вина [54]. Ранее была показана высокая вероятность присутствия вина для ойнохойи № 12 из погребения № 370 грунтового могильника Волна-1 [43]. Выделенный из  ойнохойи №12 штамм Sporolactobacillus, по исходным результатам секвенирования ПЦР-фрагментов гена 16Sр-РНК [43], был генетически близок к перспективному для пищевой промышленности виду S. pectinivorans [55], однако после уточнения расположения штамма на филогенетическом древе, с  учетом статистической достоверности порядка его ветвления, определенной с помощью анализа 1000 альтернативных деревьев, штамм в настоящее время отнесен к виду Sporolactobacillus vineae (см.  Приложение 4, рис. 1). Неоднозначный статус этого штамма указывает на его новизну, для доказательства которой необходима полная расшифровка генома.

Heyndrickxia coagulans (до 2020 года Bacillus coagulans) применяется в процессах изготовления йогурта [56]. Многочисленные пробиотические штаммы H. coagulans способствуют росту полезных бактерий и подавляют рост вредных, а также положительно влияют на иммунную систему человека и  животных [57; 58; 59].

Другой вид Heyndrickxia – H. Acidiproducens, обладает мощной кислотообразующей способностью [60], вырабатывает антибактериальные и антиоксидантные метаболиты, эффективные в отношении патогенов с множественной лекарственной устойчивостью [61; 62], используется при ферментации йогурта на основе растительного сырья [63].

Bacillus licheniformis был выделен нами из детской миски, где микробиологическая реконструкция погребальной пищи показала наличие молочного жира и белка. Исходное присутствие B. Licheniformis в молочном продукте более вероятно, чем загрязнение из почвы, поскольку основной средой обитания этих бацилл является молоко и продукты его переработки [64]. В качестве одного из основных агентов порчи молока B. Licheniformis выступает благодаря своей способности к быстрому росту. Некоторые штаммы B. Licheniformis вырабатывают токсины и вызывают отравления [65], однако его безопасные пробиотические штаммы используются в производстве сыров [66].

Bacillus thuringiensis повсеместно встречается в окружающей среде и тесно связан с пищей [67].

Дрожжи Candida sorbosivorans, выделенные из миски и корчаги курганного могильника Октябрьский, являются частью естественной микрофлоры меда [68].

Таким образом, штаммы пищевых микроорганизмов, выделенные нами из грунта погребальных сосудов, оказались генетически близки к современным пробиотическим и патогенным штаммам.

Выводы

В качестве оптимального маркера присутствия пищи в погребальных сосудах может рассматриваться трофическая группа липолитических микроорганизмов, как наиболее устойчивая к условиям погребения.

В выборке из 42 сосудов, найденных в разновозрастных погребениях различных регионов, только в четырех случаях не удалось выявить микробиологические следы пищевых продуктов. В грунте из  16  сосудов установлена низкая интенсивность роста микроорганизмов на твердых питательных средах. Однако из половины сосудов рассматриваемой группы были выделены консорциумы бактерий, способных к сбраживанию молока, что может свидетельствовать об исходном присутствии ферментированной пищи – как молочной, так и мясной.

В 12 сосудах выявлена высокая численность микроорганизмов на твердых питательных средах. Максимальные показатели численности липолитических и протеолитических бактерий в таких сосудах могут быть связаны с исходным присутствием твердой пищи – продуктов типа сыра или творога.

В двух сосудах из детских погребений могильников Октябрьский и Братские-1 курганы с высокой вероятностью находился жидкий молочный продукт. Из грунта миски в детском погребении был выделен Bacillus licheniformis, основной средой обитания которого является молоко и продукты его переработки.

Впервые проведена оценка таксономической принадлежности бактерий и дрожжей из погребальных сосудов. Идентифицированы штаммы бактерий, осуществляющих молочнокислое брожение – Sporolactobacillus terrae, Sporolactobacillus vineae, Heyndrickxia coagulans и Heyndrickxia acidiproducens, дрожжи Candida sorbosivorans, а также патогенные бактерии Clostridium botulinum и Bacillus licheniformis.

Обнаружение как пробиотических, так и патогенных микроорганизмов в грунте погребальных сосудов имеет важное значение для оценки и мониторинга микробных сообществ погребальных комплексов, где захоронение пищевых продуктов способствовало обогащению микробного разнообразия и обеспечивало консервацию древних биотехнологически значимых штаммов.

Приложение 1

Для оценки трофической структуры микробных сообществ придонного грунта погребальных сосудов использовались следующие питательные среды (таблица 1): среда для липолитических микроорганизмов на основе твин-80; среда для протеолитических микроорганизмов – дрожжевой или мясной пептонный агар – ДПА/МПА; среда М-17, используемая для выделения молочнокислых бацилл из природных источников; среда для амилолитических микроорганизмов – крахмалоаммиачный агар КАА; среда для олиготрофных микроорганизмов – почвенный агар ПА.

Навеска почвы 1 г помещалась в стерильную пластиковую пробирку (50 мл) и заливалась 10 мл стерильного 0.5% раствора пирофосфата натрия с добавлением 0.1% пирувата натрия. Почвенная суспензия обрабатывалась ультразвуком на дезинтеграторе QSONICA CL-188 на 30% мощности прибора. Суспензию разводили в 100 –1000 раз путем последовательного перенесения 1 мл суспензии в 9 мл стерильной водопроводной воды. Затем 50 мкл. итогового разведения наносили на поверхность твердой питательной среды в чашках Петри. Инкубация колоний проводилась в термостатах при температуре 25 °С в течение 5 – 7 суток.

Таблица 1. Состав питательных сред для культивирования почвенных и пищевых микроорганизмов из грунта сосудов / Table 1. Composition of nutrient media for the cultivation of soil and food-related microorganisms isolated from vessel sediment.

Название питательной среды	Состав питательной среды (г/л)
Твин	Твин-80 (10), пептон (10), натрий хлористый (5), кальций хлористый (0.01), агар (20)
ДПА/МПА	Дрожжевой или мясной пептон (10), агар (20)
М-17	Лактоза (5), пептон соевый (5), пептон мясной (2.5), пептон казеиновый (2.5), экстракт дрожжевой (2.5), экстракт мясной (5), кислота аскорбиновая (0.5), натрия 3-глицерофосфат (19), магний сернокислый (0.25), агар (12.75)
КАА	Крахмал растворимый (10), аммоний сернокислый (2), калий фосфорнокислый двузамещенный (1), магний сернокислый 7-водный (1), натрий хлористый (1), кальций углекислый (3), агар (15)
ПА	Чернозем (200), агар (20)

Приложение 2

Для выделения чистых культур микроорганизмов, способных к ферментации пищевых продуктов, навеску придонного грунта заполнения из погребальных сосудов помещали в пробирку и заливали стерильным бульоном Elliker в соотношении 1:5. Инкубация накопительной культуры составляла от  2  суток (образцы из погребений Армении) до 30 суток (образцы из погребений юга России).

Для получения колоний смешанных культур молочнокислых бактерий и дрожжей после инкубации в жидких питательных средах были использованы следующие твердые питательные среды (таблица 2): Среда на основе томатного сока – томатно-соковый агар ТСА, стандартные среды MRS и Rogosa, дифференциальный агар Валлерштейна ДАВ, используемый для выделения молочнокислых бацилл, с подавлением роста плесневых грибов.

Инкубация колоний смешанных культур молочнокислых бактерий и дрожжей проводилась в анаэростатах «Anaerobic system BBL Gas Pac 100» при концентрации СО2 более 10%.

Микропрепараты готовили с помощью бактериологической петли, клетки окрашивали акридином оранжевым в концентрации 0.05 мкг/мл, высушивали и просматривали под люминесцентным микроскопом «Leica DM 2000» с использованием синего светофильтра.

Таблица 2. Состав питательных сред для выделения бактерий, способных к сбраживанию молока, из грунта сосудов / Table 2. Composition of nutrient media for the isolation of milk-fermenting bacteria from vessel sediment.

Название питательной среды	Состав питательной среды (г/л)
Elliker (Sigma)	Казеина гидролизат (20), экстракт дрожжевой (5), желатин (2.5), глюкоза (5), лактоза (5), сахароза (5), натрий хлористый (4), натрий уксуснокислый (1.5), кислота аскорбиновая (0.5)
MRS (Sigma)	Пептон казеиновый (10), экстракт мясной (8), экстракт дрожжевой (4), глюкоза (20), калий фосфорнокислый двузамещенный (2), аммоний лимоннокислый двузамещенный (2), натрий уксуснокислый (5) магний сернокислый (0.2), марганец сернокислый (0.04)
ТСА (Sigma)	Томатный порошок (20), гидролизат казеина (10), пептонизированное молоко (10), агар (11)
Rogosa (Sigma)	Пептон казеиновый (10), экстракт дрожжевой (5), глюкоза (20), калий фосфорнокислый однозамещенный (6), аммоний лимоннокислый (2), натрий уксуснокислый (15), магний сернокислый (0.575), сульфат железа II (0.034), марганец сернокислый (0.12), агар (15).
ДАВ (Sigma)	Циклогексимид (0.004), бромкрезоловый зеленый (0.022), кальций хлористый (0.125), казеина гидролизат (5), декстроза (50), хлорид железа III (0.0025), магний сернокислый (0.125), марганец сернокислый (0.0025), калий фосфорнокислый однозамещенный (0.55), калий хлористый (0.425), экстракт дрожжевой (4), агар (14)

Приложение 3

Для таксономической идентификации чистых культур проводилась полимеразная цепная реакция и дальнейшее секвенирование, с использованием универсальной праймерной системы (11f-1492r). Для оценки таксономической принадлежности бактерий проводилось секвенирование ПЦР-фрагментов гена 16Sр-РНК, для оценки таксономической принадлежности грибов – секвенирование ПЦР-фрагментов гена рибосомального оперона ITS1 – 5.8S – ITS2 – 28Sр-РНК. В данном случае использовалась праймерная система ITS5 – LR5, позволяющая апмлифицировать участок ДНК, включающий межгенную область, 5.8s РНК и участок 28s РНК. Температурно-временной профиль ПЦР включал ряд циклов: первый – 94◦С × 9 мин, 55оС × 1 мин, 72◦С × 2 мин; последующие 30 циклов – 94◦С × 1 мин, 55◦С × 1 мин, 72◦С × 2 мин; завершающий цикл – 72◦С × 7 мин. Продукты ПЦР анализировали с помощью электрофореза в 1% геле агарозы (для бактерий) и 2% геле агарозы (для грибов) при напряженности электрического поля 6 В/см.

Выделение и очистку продуктов ПЦР проводили из легкоплавкой агарозы с применением набора реактивов Wizard PCR Preps (Promega, США), согласно рекомендациям производителя. Секвенирование полученных ПЦР-фрагментов проводили по методу Сэнгера с соавторами с помощью набора реактивов BigDyeTerminator v.3.1 (Applied Biosystems, Inc., USA) на генетическом анализаторе 3730 (Applied Biosystems, Inc., USA) ЦКП “Биоинженерия” ФИЦ Биотехнологии РАН согласно инструкциям производителя. Филогенетический анализ полученных нуклеотидных последовательностей проводили на основе программы BLAST в базе данных NCBI GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

Приложение 4.

Филогенетическое положение выделенных штаммов определялось с использованием метода “maximum likelihood”. Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью “bootstrap” – анализа 1000 альтернативных деревьев.

Наталья Николаевна Каширская

Институт физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН, г. Пущино

Автор, ответственный за переписку.
Email: nkashirskaya81@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-8353-3192
Scopus Author ID: 15062725100

Россия

кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник

Лаборатория археологического почвоведения

Елена Владиславовна Чернышева

Институт физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН, г. Пущино

Email: e.chernyysheva@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-8526-4798
Scopus Author ID: 56368578400

Россия

кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник

Татьяна Эдуардовна Хомутова

Институт физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН, г. Пущино

Email: khomutova-t@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0002-9856-3025
Scopus Author ID: 6602901182
ResearcherId: J-6595-2018

Россия

кандидат биологических наук,

ведущий научный сотрудник

Алексей Максимович Евстигнеев

Email: eustigneew.oleg2015@yandex.ru

Россия

независимый исследователь

Александр Александрович Клещенко

Институт археологии РАН

Email: sansanych@bk.ru
ORCID iD: 0000-0001-7577-8835

Россия

кандидат исторических наук

старший научный сотрудник

Владимир Юрьевич Малашев

Институт археологии РАН

Email: malashev@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-1276-7650
Scopus Author ID: 6507798495
ResearcherId: G-3812-2018

Россия

кандидат исторических наук

старший научный сотрудник

Роман Алексеевич Мимоход

Институт археологии РАН

Email: mimokhod@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-4584-4747

Россия

кандидат исторических наук

старший научный сотрудник

Дмитрий Игоревич Зенюк

Азовский историко-археологический и палеонтологический музей-заповедник

Email: dspl-online@dspl.ru

Россия

младший научный сотрудник

отдела археологии 

Симон Геворгович Амаякян

Институт археологии и этнографии Национальной академии наук Республики Армения

Email: s.hmayakyan@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-0191-5395

Армения

кандидат исторических наук

старший научный сотрудник

Арсен Александрович Бобохян

Институт археологии и этнографии Национальной академии наук Республики Армения

Email: arsen.bobokhyan@sci.am
ORCID iD: 0000-0002-2277-8281
Scopus Author ID: 38261221600

Армения

кандидат исторических наук

ведущий научный сотрудник

Александр Борисов Владимирович

Институт физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН, г. Пущино

Email: a.v.borisovv@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-5031-7477
Scopus Author ID: 34567600900

Россия

кандидат биологических наук

ведущий научный сотрудник

Дополнительные файлы

Нет дополнительных файлов для отображения

Просмотры

Аннотация - 2044

PDF (Russian) - 153